类器官（Organoids）是从干细胞或多能干细胞培养分化而成的三维结构，能够在一定程度上重现真实器官的结构和功能。如何准确判断类器官的成熟程度，并在适当的时间进行传代，是确保类器官实验顺利进行的关键。以下将介绍判断类器官成熟的标准以及传代的具体流程。

一、判断类器官成熟的标志

1. 形态学观察

成熟的类器官通常具备均匀的大小和规则的形状。不同类型的类器官在形态特征上有所不同。例如，肠道类器官通常呈囊状，而脑类器官可能呈现类似神经球的结构。一般情况下，正常人体肠道类器官在培养12至14天后即可开始传代。

2. 细胞组成

成熟的类器官应包括多种细胞类型。例如，肠类器官内应包含肠上皮细胞、杯状细胞以及潘氏细胞等。可以通过免疫荧光染色或流式细胞术检测特定细胞标志物（如Lgr5+干细胞、MUC2+杯状细胞）来评估细胞类型的多样性。此外，细胞的分化程度也很重要，成熟的类器官应表达相应的成熟细胞标志物（如肠类器官中的Villin或脑类器官中的NeuN），可采用蛋白质免疫印迹（WB）来检测其表达情况。

3. 功能检测

成熟类器官应具备一定的功能。例如，可以检测肠类器官的分泌功能（如黏液分泌）或胰腺类器官的胰岛素分泌能力。对于神经类器官，可通过膜片钳等技术评估神经元的电生理活性。同时检测类器官的代谢活性（如ATP生成、氧气消耗率）以及是否表现出预期的功能（例如肠类器官的CFTR活性或者心脏类器官的自主跳动能力）。

4. 基因表达分析

可通过qPCR或RNA测序检测与成熟相关的基因表达水平，包括肠类器官中的分化标志物和脑类器官中的神经元特异性基因。同时，可检测类器官的DNA甲基化和染色质状态，以判断其是否接近体内成熟组织的状态。

二、类器官传代流程

1. 判断何时进行传代

通常，当类器官直径达到200-500μm，或者类器官的生长速率明显减缓时，通常需要进行传代。如果培养基变黄则也表示需要传代。此外，如果类器官的结构开始变得不规则或出现了中心坏死现象，应尽快进行传代。

2. 传代步骤

收集类器官时，可以用移液器轻轻吹打培养基，将类器官从基质胶中释放并转移至离心管中。接下来，需加入适量的消化酶，并轻轻吹打以解离成小细胞团或单细胞，消化时间需根据类器官类型和消化酶浓度来调节，通常为5至15分钟。完成消化后，加入含血清的培养基以终止消化反应，并用移液器轻轻吹打使细胞团分散均匀。随后，以300-500g离心5分钟，弃去上清，用新鲜培养基重悬细胞团。最后，将细胞团与基质胶混合，并接种于预热的培养板中，待基质胶凝固后再加入类器官培养基，最后将培养板放回37°C、5% CO₂的培养箱中继续培养。

注意事项

• 消化时间控制：消化时间过长可能导致细胞损伤，过短则可能导致类器官解离不完全。
• 基质胶品质：使用高品质的基质胶，确保其均匀分布。
• 培养基优化：根据类器官类型选择合适的培养基成分（如Wnt、R-spondin、EGF等生长因子），以确保类器官能够正常分化。
• 污染防控：应严格执行无菌操作，避免类器官受到污染。

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